醫學魔改大(dà)師玩跨界，CRISPR遇見分(fēn)子診斷

Release time: 2022-01-19

引言

2020年，瑞典皇家科學院将諾貝爾化學獎授予Jennifer Doudna教授Emmanuelle Charpentier博士以表彰她們在CRISPR/Cas9基因編輯方法上所做出的貢獻。得益于此，基因療法随之大(dà)放(fàng)異彩，在很短的時間内完成了由基礎理論到初步科學驗證，再到實際應用的快速發展。但這一(yī)科學技術卻也一(yī)直伴随着争議的聲音，給人無限遐想的同時，也帶來一(yī)些隐憂。瑕不掩瑜，這些暫時的争議阻擋不了人類對于這一(yī)充滿潛力的新技術擴展應用的嘗試。近年來，以基因編輯而聞名的生(shēng)物(wù)技術正被用于開(kāi)發便攜式、家庭式的傳染病和癌症測試等分(fēn)子診斷領域。CRISPR/Cas的神秘面紗正在被緩緩揭開(kāi)。

安永生(shēng)命科學與醫療健康行業課題組對話(huà)專家，帶你走近：CRISPR/Cas基因編輯遇見分(fēn)子診斷。

專家介紹

張明東博士

現任波士頓科學亞太區首席醫務官及醫學事務和衛生(shēng)經濟副總裁

前美國食品藥政管理局醫務官和流行病學家

曾任職香港中(zhōng)文大(dà)學醫學院教授

美國國立衛生(shēng)研究院國立癌症研究所博士後

美國貝樂醫學院分(fēn)子病毒學博士

“CRISPR/Cas技術是一(yī)種逆天改命的手段，讓人産生(shēng)很多瑰麗和美好的遐想。”

王弢博士

中(zhōng)國抗癌協會腫瘤标志(zhì)專業委員(yuán)ctDNA技術專家委員(yuán)會副組長

江蘇省腫瘤分(fēn)子診斷工(gōng)程技術研究中(zhōng)心主任

蘇州大(dà)學（特聘-産業方向）教授

複旦大(dà)學醫學博士

“CRISPR的應用，起步于醫學，終将不止于醫學。”

對話(huà)專家

CRISPR/Cas一(yī)直存在争議，您建議安永公衆号的讀者如何正确理解這一(yī)技術？

張明東：

CRISPR是原核生(shēng)物(wù)基因組内的一(yī)段重複序列。Cas基因則位于CRISPR基因附近，或散布于基因組其他地方，該基因編碼的蛋白(bái)均可與CRISPR序列區域共同發生(shēng)作用。因此，該基因被叫做CRISPR關聯基因，即Cas。

生(shēng)命進化史上，某些細菌爲了将入侵的病毒基因清除，進化出CRISPR/Cas基因剪切防禦系統，能夠在遭到病毒入侵後，把病毒基因的一(yī)小(xiǎo)段存儲到自身 DNA 裏稱爲 CRISPR 的存儲空間中(zhōng)。這樣，當病毒再次入侵時，細菌便可以根據存儲的片段識别病毒，并将病毒的DNA切斷達到抑制作用。這一(yī)機制真正體(tǐ)現了生(shēng)命之間的微妙平衡，相生(shēng)相克又(yòu)不斷進化。

CRISPR/Cas技術的發明，爲臨床醫學提供了超越以往的工(gōng)具。原本不可治愈的疾病有了治愈的可能，比如基因變異導緻的各類型遺傳疾病、HIV等難以根治的病毒感染，糖尿病易感性人群的基因改造等，甚至還有可能成爲更有效的癌症治療手段。不誇張地說，CRISPR/Cas技術可以被稱爲是一(yī)種逆天改命的手段，讓人産生(shēng)很多瑰麗和美好的遐想。

然而，重大(dà)的科技發現常常伴有不容忽視的兩面性。火(huǒ)藥的發明，不僅帶來礦産開(kāi)發、道路建設等生(shēng)産力的提升，也招緻槍械帶來的巨大(dà)人員(yuán)傷亡；20世紀最偉大(dà)的發現“相對論”，開(kāi)啓了高效、清潔的核能應用，卻也讓人們籠罩在原子彈的陰霾之下(xià)。對CRISPR基因編輯技術來說，它使科學家擁有改造人類疾病基因或消滅生(shēng)物(wù)的能力，也帶來不受倫理管控下(xià)生(shēng)物(wù)武器泛濫甚至畸形生(shēng)物(wù)變異的可能性。這一(yī)技術發明無疑是人類自火(huǒ)器時代到核能時代以來所面臨的最嚴峻挑戰。

王弢：

CRISPR技術開(kāi)啓了基因編輯的大(dà)幕！這是一(yī)項了解生(shēng)命本質、挽救生(shēng)命甚至創造生(shēng)命的革命性技術，期待在全球科學技術人員(yuán)的不懈努力下(xià)，發揮它最大(dà)的價值，逐步實現讓人類遠離(lí)衆多疾病折磨，實現更健康和更長壽生(shēng)活的更多應用。2020年新冠疫情突然爆發，恰此時mRNA疫苗大(dà)獲成功，mRNA治療藥物(wù)獲得快速發展。突破性的生(shēng)物(wù)技術不斷湧現，“21世紀是生(shēng)物(wù)技術時代”的預言正在成爲現實。”

誠如明東博士所言，作爲這個時代光彩奪目明珠的CRISPR有兩面性，如何防範這個魔法無窮的工(gōng)具不被惡意群體(tǐ)肆意濫用，是人類大(dà)家庭必須直面的共同課題。我(wǒ)始終相信，每一(yī)次技術突破的洗禮，帶給人類的不僅是生(shēng)産力的巨大(dà)提升，更是人類不斷認知(zhī)自然和自身的過程，相信在CRIPSR等生(shēng)物(wù)技術的加持下(xià)，人類将會擁有更美好的家園。

對于11月12日《Nature Communication》上發表的關于CRISPR/Cas9基因編輯或許會讓細胞産生(shēng)與癌症相關的基因突變形式，您覺得對産業界的影響是什麽？

張明東：

CRISPR技術自問世以來，就獲得“基因魔剪”的稱号，在醫學科研領域可以說是百花齊放(fàng)、碩果累累，同時在農業、環境等領域也展現了光明的前景。2020年發現CRISPR/Cas技術的科學家Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士榮獲諾貝爾化學獎，這是諾貝爾獎曆史上少見的從發現到獲獎僅數年的現象，也說明這是一(yī)項多麽重要的發現。

近期，數篇Nature子刊文章提示，CRISPR會在體(tǐ)内引起不可預測的的脫靶效應，甚至癌症相關的突變。因而，CRISPR技術到底是“魔剪”還是“亂剪”，一(yī)時衆說紛纭。從CRIPSR技術偏靶造成的異常突變而言，這隻是這項革命性技術在應用中(zhōng)的一(yī)個插曲，說明現在的CRISPR編輯技術還不夠精準，還需要更多優化。需要進一(yī)步優化到單堿基編輯，優化到特定部位的單堿基編輯，實現更精細精确的基因編輯操作。所以我(wǒ)想，大(dà)家不要因爲目前CRISPR技術有一(yī)些瑕疵，就下(xià)結論說它多麽不堪或者多麽危險。這些瑕疵是完全可以克服的，隻是時間長短的問題。

王弢：

CRISPR技術出現後，作爲一(yī)項通用的技術，在實際應用的領域或方向必然存在一(yī)些瑕疵，這是十分(fēn)正常的，需要的是科研人員(yuán)不斷嘗試、不斷改進，逐步實現産業應用。如果都是一(yī)路順風，我(wǒ)想那才是需要每個人擔心的。每個細分(fēn)方向或具體(tǐ)疾病應用的CRISPR關鍵細節技術的開(kāi)發，需要再多一(yī)點時間，我(wǒ)們會看到更多的實際結果，可能許多不可治療的疾病都将變爲可治愈的疾病，這一(yī)天并不遙遠。總體(tǐ)而言，CRISPR的應用，起步于醫學，終将不止于醫學。

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能否談一(yī)談CRISPR技術目前較爲成熟的醫學應用領域，在哪些方面爲人類帶來福音？

張明東：

目前進展明顯的治療領域，主要包括：

①癌症治療，主要針對免疫細胞改造，突變細胞的基因修補或切除等，有多個臨床研究，部分(fēn)獲得積極的結果。

②遺傳疾病，比如亨廷頓氏舞蹈症病(Huntington ' s disease)、杜氏肌營養不良症（DMD基因）等已有研究報道，進展到臨床II期及之後也有報道，但還需要公布相關臨床數據。

③3HIV等病毒的體(tǐ)内整合感染方面的應用，我(wǒ)想這是近期科研人員(yuán)比較有把握會有重要進展的領域，值得大(dà)家關注。

王弢：

在醫學診斷領域，CRISPR-based核酸檢測技術最有可能成爲新一(yī)代的分(fēn)子診斷平台，尤其在遠離(lí)PCR實驗室場景下(xià)的應用。

醫學診斷是現代醫學發現疾病的入口，提供了疾病的快速預警和精準診斷，讓治療有針對性的明确目标。數十年來，核酸檢驗領域，真正得到廣泛應用的技術僅有PCR和NGS，它們當中(zhōng)一(yī)個實現了單靶标或少靶标檢驗，一(yī)個實現了多靶标并行檢驗。兩者都依賴于大(dà)型醫學檢驗實驗室、專業操作和大(dà)型儀器的應用場景，是一(yī)種遠離(lí)疾病人群個體(tǐ)和現場的檢驗。

而快速準确診斷感染性疾病應用是目前緊迫的需求，是指導疫情防控，保障公共衛生(shēng)安全，避免大(dà)範圍傳播的關鍵。這一(yī)點無論是對大(dà)型醫療中(zhōng)心，還是在缺醫少藥的基層醫療衛生(shēng)機構，或是欠發達的國家和地區都至關重要。理想的診斷方式應該價格低廉、準确性高、快速、操作簡便（無需專業人士操作）以及無需專業設備和基礎設施要求。

從我(wǒ)個人的意見以及我(wǒ)們的實踐來看，CRIPSR-based核酸檢測技術是第一(yī)個能真正實現精确、現場甚至居家自測的醫學應用級診斷平台。

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如何認識CRISPR-based診斷技術，它有哪些重要突破？能否談一(yī)談該技術目前較爲成熟的應用領域，在哪些方面爲人類帶來福音？

張明東：

CRISPR/Cas技術以出衆的基因編輯能力聞名于世，但顯然它的技術應用範圍絕不僅限于基因編輯。CRISPR/Cas技術的創立者之一(yī)Jennifer Doudna教授早在2017年就将該技術應用于RNA檢測，創辦Mammoth Biosciences公司，利用Cas12a的非特異性ssDNA降解能力開(kāi)發出新的核酸快速檢測方法。幾乎同時，CRISPR研究先鋒者之一(yī)的華人科學家張鋒教授于2017年創辦Sherlock BioSciences公司，利用Cas13蛋白(bái)的天然RNase活性改進，建立了快速核酸檢測SHERLOCKTM（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter unlocking）平台。

2021年，基于CRISPR檢測平台被美國《Science》雜(zá)志(zhì)譽爲“下(xià)一(yī)代分(fēn)子診斷技術”! CRISPR颠覆傳統醫學：一(yī)張紙(zhǐ)、幾分(fēn)鍾，即可診斷疾病！該技術将在病原檢測、疾病篩查、精準醫療等衆多領域展現巨大(dà)的應用潛力。

王弢：

Mammoth Biosciences的“DETECTR BOOST”技術平台，可在30分(fēn)鍾内獲得診斷結果。Sherlock Biosciences開(kāi)發了首個獲美國FDA緊急使用授權的基于CRISPR技術新冠病毒測試，被評爲2021年“全球最具創新力10大(dà)生(shēng)物(wù)技術公司”之一(yī)。

在國内，有多家生(shēng)物(wù)技術公司參與開(kāi)發了CRISPR-based核酸檢測技術的新冠病毒診斷産品，主要還是集中(zhōng)于醫學實驗室場景下(xià)的操作。爲真生(shēng)物(wù)開(kāi)發了恒溫擴增+CRISPR聯合應用的小(xiǎo)型化單人份裝置，首次實現基于CRISPR新冠病毒核酸的單人自測或現場快檢，除應用于國内渠道外(wài)，也在積極申報美國FDA緊急使用授權（EUA）。

CRISPR-based快速檢測可實現各類微生(shēng)物(wù)的居家自測或現場檢驗，類似于現在家用的血糖監測。我(wǒ)想，在不遠的将來，一(yī)種全新的醫療形态将會逐步呈現。

張明東：

目前CRISPR-based核酸檢測技術具有明顯的高靈敏度和高特異性的優勢，已實現1copy/μL檢測，甚至高于常規的熒光PCR，在病原體(tǐ)檢測如SARS-CoV-2檢測方面已實現臨床應用。

應用上面，新CRISPR測試能夠節省時間和金錢，甚至不再需要去(qù)看醫生(shēng)就能做出診斷。這種診斷可以在幾分(fēn)鍾内得出明确的陽性或陰性結果，類似于家庭懷孕自測。測試結果可以通過手機上的應用程序發送給醫生(shēng)，醫生(shēng)可以立即開(kāi)出處方或給出治療建議。這些測試還可以在醫院使用，以快速确定感染病原體(tǐ)，以及引起腫瘤的突變基因，或者快速預測人們是否有罹患某種疾病的遺傳基因。

相比qPCR技術，CRISPR核酸檢測技術主要有哪些優勢？CRISPR核酸檢測技術産業化尚需解決的核心問題有哪些？從國外(wài)的技術和臨床試驗對比來看，國内CRISPR核酸檢測技術正處于怎樣的發展階段？

王弢：

相比qPCR，CRSIPR核酸檢測技術擁有獨特優勢：

①複雜(zá)背景下(xià)的高靈敏度，可對aM（10-18M）濃度的靶核酸分(fēn)子進行高效檢測；而qPCR技術很難實現複雜(zá)背景下(xià)靶分(fēn)子的有效擴增。

②複雜(zá)背景下(xià)的高特異性。CRISPR核酸檢測技術具有極爲優異的抗幹擾性能，可實現對單堿基異常的精确監測；qPCR影響因素多，抗幹擾能力差，難以避免假陽的存在。

③更爲簡易的操作，無需依賴較大(dà)的儀器，10-60分(fēn)鍾内完成擴增全程；qPCR依賴多步驟的複雜(zá)操作，嚴格環境控制，耗時1-3小(xiǎo)時，需要複雜(zá)的大(dà)型精密儀器。

張明東：

CRISPR核酸檢測技術具有高靈敏度、高特異性和極爲顯著的抗幹擾等優勢，但如何實現核酸預擴增和CRISPR一(yī)體(tǐ)化反應是一(yī)個難題，以及如何實現單人份或高通量快速檢測也是不同場景下(xià)應用的需要，還有各種關鍵生(shēng)物(wù)酶的産業化是需要解決的核心問題。

王弢：

國内CRISPR核酸檢測技術的發展處于快速發展的起步階段，整個産業鏈還不是很成熟。成熟的CRISPR核酸檢測技術如果應用于院外(wài)場景，需做到：

①快速，通常1小(xiǎo)時内完成檢測。

②防污染，全封閉操作。

③高性能，靈敏度和特異性高于或等同于qPCR。

④便捷，各檢測試劑All in于一(yī)管。

⑤常溫儲運。

結束語

基因組中(zhōng)的微小(xiǎo)改變，會帶來有機體(tǐ)的巨大(dà)變化。随着科研人員(yuán)對生(shēng)命系統的研究不斷深入和資(zī)本市場的強力支持，我(wǒ)們有理由相信，在不遠的将來，我(wǒ)們将會看到CRISPR/Cas更加廣泛、成熟地運用于臨床，有效治療各種遺傳疾病。但值得警惕的是，這項革命性的技術也是一(yī)把雙刃劍，隻有完善相關法律法規，厘清科技與倫理的邊界，規範科研行爲，才能引導基因編輯領域的健康發展。

參考資(zī)料

近日，一(yī)篇發表在國際雜(zá)志(zhì)Nature Communications上題爲“A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing”的研究報告中(zhōng)，來自美國國立衛生(shēng)研究院等機構的科學家們通過研究發現，基于CRISPR/Cas的基因編輯（尤其是基因敲除）或許會讓正常細胞産生(shēng)與癌症相關的基因突變形式，“基因剪刀”再引争議。

本文中(zhōng)的觀點僅代表受訪者個人觀點，并不一(yī)定反映安永全球機構或其成員(yuán)機構的觀點。

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